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有濟說 | 血栓類疾病模型的制備與藥效學評價

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正常情況下機體內(nèi)凝血和抗凝血系統(tǒng)相互拮抗，使血液呈液體狀態(tài)完成全身的血液循環(huán)[1]。但機體凝血和抗凝血系統(tǒng)功能在受到某些因素的影響，如外傷和感染時會發(fā)生紊亂，導致血栓形成。血管內(nèi)皮損傷、血流紊亂和凝血反應異常是影響血栓形成的主要因素，通常三個因素相互作用、但常以某一因素為主[2]。在血栓性疾病中，有缺血性腦血管病、心肌梗死、肺栓塞以及手術(shù)或外傷后引起的各種動靜脈血栓等。這些血栓性疾病涉及多學科并且發(fā)病率高，而且具有很高的致死率和致殘率。因此建立臨床相關(guān)性高、穩(wěn)定性高的血栓類動物模型，對于支持和促進血栓性疾病治療的藥物開發(fā)是十分必要的。


通常，按照造模血栓的位置，可分為體外、半體內(nèi)和體內(nèi)三類血栓模型。其中每種模型都有特定的應用范圍，需按照具體的研究目的和藥物作用機制選擇適合的模型。本文將對目前抗血栓藥物的非臨床藥效學研究的主要評價模型進行介紹。






一、體外血栓模型

采集動物的新鮮動脈血液，用枸櫞酸鈉抗凝，制備血栓，試驗前需用PBS對血栓進行充分洗滌至無明顯紅細胞掉落。選取合適的反應體系將藥物和血栓孵育一定時間后，取上清液進行OD值測量，以O(shè)D值的高低反應溶栓效果（圖1）。


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【圖1】阿替普酶在體外血栓模型中的溶栓效果






二、半體內(nèi)血栓模型

半體內(nèi)血栓模型采用的是大鼠動靜脈旁路模型。大鼠麻醉后仰臥姿勢固定，分離左側(cè)頸總動脈和右側(cè)頸外靜脈，然后取一根用生理鹽水浸泡滿的聚乙烯套管（由三段聚乙烯管制成，在中間管放入放置一根5cm長的絲線），一端先插入左側(cè)頸總動脈，另一端插入右側(cè)頸外靜脈，絲線固定。動脈端用動脈夾夾住，打開動脈夾后血液從右側(cè)頸總動脈經(jīng)聚乙烯管返回左頸外靜脈形成血流回路[3]。血流中的血小板接觸旁路循環(huán)中的絲線粗糙面時，可發(fā)生黏附、聚集，環(huán)繞絲線表面形成血栓。可于動靜脈旁路開通之前或之后給予藥物，以絲線附著的血栓濕重和干重評判藥物抗血小板聚集效果（圖2）。


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【圖2】大鼠動靜脈旁路血栓模型





三、體內(nèi)血栓模型

3.1

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機械誘導法

是指用微型刮匙、銀針等器械刮傷血管內(nèi)膜，使內(nèi)皮下細胞外基質(zhì)裸露促使血小板與膠原接觸而被激活和粘附，啟動凝血過程導致血栓形成。通常采用家兔，麻醉后分離股動脈用微型血管夾夾住上下兩端，中間留一定長度的血管，然后用微型刮匙搔刮血管內(nèi)膜，術(shù)后24 h即開始有血栓形成，以血栓重量為評價指標[4]。

3.2

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電流損傷法

直流電刺激血管壁時引發(fā)氧自由基形成造成內(nèi)皮細胞損傷，導致血管內(nèi)膜變得粗糙不平，引起血小板黏附、聚集。在靜脈血管及動脈血管中均適用，包括頸動脈、下腔靜脈等。實驗大鼠麻醉后，鈍性分離其右側(cè)頸總動脈約15mm長，將血流檢測探頭鉤在動脈的遠心端上，刺激電極鉤于近心端動脈內(nèi)膜上刺激,血栓阻斷動脈血流后血流驟降，記錄從電刺激開始到血流驟降所需時間即為血栓形成時間。

3.3

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光化學誘導法

本法系將光敏物質(zhì)，如虎紅B、熒光素鈉等，注射入機體后在特定波長光線的照射激發(fā)下，光敏物質(zhì)產(chǎn)生單態(tài)氧繼而損傷血管內(nèi)皮細胞引起白細胞附壁激發(fā)血小板粘附、聚集而形成血栓。光化學法可以用于建立腦血栓模型和冠狀動脈血栓模型等。麻醉大鼠后經(jīng)左側(cè)顳部入路，于左眼外眥和左耳外耳道連線上作一垂直的長約2cm的弧形切口，分離顳肌去除顴弓，撐開下頜關(guān)節(jié)，在卵圓孔前上方用顱骨鉆磨薄顱骨，拆開后即可見大腦中動脈（MCA），靜脈注射虎紅B用激光MCA可形成血栓，造成腦梗死，可通過神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死面積評價。冠狀動脈血栓模型是在呼吸機的輔助下，開胸暴露左冠狀動脈前降支，連接心電圖監(jiān)測梗死情況，注射光敏物質(zhì)后激光照射，ST段抬高0.1 mV時表明血栓形成，心肌已經(jīng)缺血，可以通過心臟超聲和TTC染色評價[5]。

3.4

?

化學藥物誘導法

是指使用一些特殊化學試劑（FeCl3、胰蛋白酶、過氧化氫等）使血管內(nèi)膜受損而形成血栓。其中常用的是FeCl3血栓形成法，此方法易操作、重復性好，形成的血栓結(jié)構(gòu)接近于人類自發(fā)形成的血栓結(jié)構(gòu)，對進一步的研究有著顯著的意義。小鼠的頸動脈血栓模型和下腔靜脈血栓模型常用FeCl3損傷，以浸滿FeCl3的小濾紙片敷在血管上方損傷血管，同時進行血管血流檢測（圖3）。FeCl3還可用于腦血栓模型，分離MCA的方法同光化學誘導法，暴露MCA后敷上浸滿FeCl3的小濾紙片15min可造成腦缺血，可通過神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死面積評價。


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【圖3】FeCl3誘導的小鼠頸動脈血栓模型

3.5

?

手術(shù)法

手術(shù)阻斷血流后，受阻的血小板與局部形成的凝血因子相互作用，加上缺氧受損的內(nèi)皮細胞引發(fā)的內(nèi)源性凝血系統(tǒng)，最終導致血栓的形成。實驗大鼠開腹后分離下腔靜脈，于左腎靜脈下方用絲線結(jié)扎下腔靜脈，然后縫合腹腔。結(jié)扎后2～6h形成血栓，取出血栓烘干后稱量血栓質(zhì)量，以血栓質(zhì)量或血栓形成百分率作為評價指標。


結(jié)語

血栓類動物模型在探究凝血機制以及藥物篩選和藥效學評價方面扮演了重要角色，為支持血栓性疾病治療的藥物開發(fā)提供了可靠的實驗基礎(chǔ)。目前已經(jīng)發(fā)展出多種成熟的動物血栓模型，鑒于每種血栓模型都有其獨特特點，因此在選擇和應用血栓動物模型時，應根據(jù)研究目的和需求選擇適當?shù)姆椒ā?/span>例如，電流損傷法適用于作動脈血栓的研究，結(jié)扎法則適用于作靜脈血栓的研究，機械損傷法在動脈血栓和靜脈血栓中均適用。對于研究腦血栓栓塞，可以選擇FeCl3血栓形成法和光化學法。


有濟醫(yī)藥的心腦血管藥效學研究平臺配備科學、先進的儀器設(shè)備，有多名經(jīng)驗豐富的專題負責人，在模型構(gòu)建和藥效學評價方面具有豐富的研究經(jīng)驗和項目申報經(jīng)驗，能夠提供全面的血栓類動物模型的藥效評價以及相關(guān)的機制探究服務。


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參考文獻：

[1] Rosendaal FR. Causes of venous thrombosis[J]. Thromb J, 2016,14(Suppl 1): 24. DOI: 10. 1186/s12959-016-0108-y.

[2] 楊光華．病理學．北京：人民衛(wèi)生出版社2001．43～47

[3] 張友恒,劉佳慰,程小桂.川續(xù)斷皂苷Ⅵ對大鼠頸總動靜脈旁路血栓作用研究[J].今日藥學,2020,30(08):530-533.

[4] 陳鐵軍,陳瑞芳,果杰．一種家兔股動脈血管內(nèi)制作血栓模型的簡便方法．實驗動物科學與管理199714（2）：33-34

[5] 郝春華,王維亭,宋書輝等.光化學法誘導大鼠冠狀動脈血栓模型的建立和應用[J].中國藥理學通報,2012,28(01):143-146.




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