組織交叉反應(yīng)（Tissue Cross-Reactivity, TCR）研究是針對(duì)含有互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）的抗體和抗體樣分子推薦的篩選試驗(yàn)，目的是確認(rèn)受試抗體與藥效靶組織抗原表位的結(jié)合，檢測(cè)抗體是否與非靶部位組織抗原結(jié)合，確定非臨床安全性試驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物種屬及為毒性靶器官的預(yù)測(cè)提供參考[1，2]。
二、抗體類藥物發(fā)展與TCR研究的應(yīng)用
單克隆抗體(Monoclonal antibody, mAb) 類藥物是當(dāng)今生物制藥研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011～2023年，有80多種單克隆抗體藥物在美國(guó)FDA獲批上市。其中人源化單克隆抗體33種，占40.24%；全人源單克隆抗體32種，占39.02%；人鼠嵌合抗體5種，占6.09%；此外還有10種抗體藥物偶聯(lián)物( Antibody-drug conjugate, ADC) ，占12.19%和2種雙特異性抗體( Bispecific antibody, BsAb) ，占2.44%[3，4]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的深入研究，抗體藥物的應(yīng)用已涵蓋腫瘤、免疫性疾病、病原體感染性疾病、代謝性疾病、遺傳性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等領(lǐng)域[3](圖1)。
【圖1】A. 抗體結(jié)構(gòu)為輕鏈(L)和重鏈(H)，具有可變區(qū)(VL, VH)和恒定區(qū)(CL, CH)，由鏈間二硫鍵連接。綠色符號(hào)為抗原結(jié)合位點(diǎn)。B. 2011-2023年獲批上市的單克隆抗體藥物。
而抗體類藥物作為一種新型的生物技術(shù)藥物具有特定的免疫性。除了與適應(yīng)癥相關(guān)本身特定的靶器官外，如果人體正常組織細(xì)胞中存在相同或相似的抗原決定簇，藥物則可能會(huì)與非靶器官外的其他組織或細(xì)胞結(jié)合，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此抗體類藥物的組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)在藥物臨床前的安全性評(píng)價(jià)中非常重要[5，6]，需要研究者合理設(shè)計(jì)TCR研究及保證試驗(yàn)操作的規(guī)范性，有效控制試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而正確判定此類藥物是否存在組織交叉反應(yīng)，幫助非臨床安全性試驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物種屬確定及預(yù)測(cè)毒性靶器官，為臨床用藥提供參考。
三、組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)原則
截至目前，關(guān)于TCR研究國(guó)內(nèi)外發(fā)布了多個(gè)指導(dǎo)原則[7-11]（表1），對(duì)TCR試驗(yàn)的科學(xué)性和技術(shù)性進(jìn)行了全面闡述。
【表1】國(guó)內(nèi)外發(fā)布的TCR研究相關(guān)指導(dǎo)原則
四、組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)解析
FDA及NMPA均要求在I期臨床試驗(yàn)開展前，應(yīng)完成供試品與組織或細(xì)胞的交叉反應(yīng)研究或與非靶組織的結(jié)合研究。免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunocytochemistry, IHC）是TCR研究的主要方法（圖2），F(xiàn)DA及NMPA還支持使用除IHC外的其他方法，例如微量細(xì)胞毒性、流式細(xì)胞術(shù)和/或放射自顯影技術(shù)等。
【圖2】IHC操作圖
對(duì)于TCR研究組織材料的規(guī)定上，國(guó)內(nèi)外指導(dǎo)原則存在一些異同之處。
FDA：PTC指南
- 應(yīng)使用快速冰凍的成人（如果有）和（或）胎兒組織來(lái)進(jìn)行人重要器官、血液成分及預(yù)期靶細(xì)胞或組織的免疫組化研究；
- 至少3個(gè)無(wú)關(guān)聯(lián)的捐獻(xiàn)者來(lái)源的人體組織；關(guān)于死者的一般信息必須收集，包括年齡、性別、民族、病史以及死亡原因。所取組織最好是年齡＞18歲的成年人；
- 首選手術(shù)組織，也可使用尚未自溶的尸檢組織；
- 特殊情況下，可使用代表性的培養(yǎng)細(xì)胞系、干細(xì)胞及胚胎/胎兒組織；
【圖3】FDA規(guī)定的TCR研究人體組織清單
NMPA：《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》
- 可以使用冰凍及石蠟包埋的各種正常臟器組織測(cè)定；
- 來(lái)源于腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體應(yīng)進(jìn)行與各種腫瘤組織的交叉反應(yīng)試驗(yàn)。
I.組織材料：
TCR研究的組織材料選取需根據(jù)申報(bào)要求進(jìn)行個(gè)體化設(shè)計(jì)。依據(jù)美國(guó)FDA的PTC指南中的表述，組織材料應(yīng)為手術(shù)或者活檢的新鮮組織，用恰當(dāng)?shù)娜〔?、固定及保存方法制備成冰凍切片。正常人體冰凍組織至少要選擇3套來(lái)自不同個(gè)體的捐獻(xiàn)者，而非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物及嚙齒類動(dòng)物冰凍組織則至少選擇2套來(lái)自不同的動(dòng)物個(gè)體。NMPA也允許選用石蠟組織樣本。
II.染色方法選擇：
免疫組織化學(xué)染色可分為直接法和間接法。最終采用何種方法取決于最佳的染色和最低的背景染色或非特異性染色，須考慮以下幾點(diǎn)∶①供試品的類型。②供試品的親和力。③臨床試驗(yàn)中的血漿濃度。④抗原決定簇的穩(wěn)定性。⑤能夠提高染色技術(shù)而使得大部分組織著色。
III.對(duì)照組設(shè)定：
對(duì)照組設(shè)定需考慮陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及分析對(duì)照三部分。
陽(yáng)性對(duì)照：
陽(yáng)性一抗對(duì)照：與靶抗原特異結(jié)合的一抗，如果是抗體類生物類似藥TCR研究，目的包括與參照藥（原研產(chǎn)品）比對(duì)，建議包括陽(yáng)性一抗對(duì)照參照藥；
- 陽(yáng)性組織對(duì)照：靶抗原表達(dá)或過(guò)表達(dá)的組織切片，包括正常組織（自身對(duì)照）、腫瘤組織或炎癥組織；
- 陽(yáng)性細(xì)胞系對(duì)照：表達(dá)靶抗原細(xì)胞系和/或轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；
- 陽(yáng)性成瘤組織：表達(dá)靶抗原轉(zhuǎn)染細(xì)胞系裸鼠成瘤組織切片。
陰性對(duì)照：
- 陰性一抗對(duì)照：與一抗或供試品相同種屬、相同亞型正常IgG或同型IgG；
- 陰性細(xì)胞系對(duì)照：無(wú)靶抗原表達(dá)的細(xì)胞系和/或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；
- 陰性組織對(duì)照：無(wú)靶抗原表達(dá)的組織切
分析對(duì)照：
- 分析對(duì)照常用磷酸鹽緩沖液代替一抗，可幫助分析背景性和/或非特異性染色是由于組織色素或染色方法引起。
IV.組織可接受性
組織可接受性對(duì)照是針對(duì)人組織普遍存在抗原的抗體，目的是提供用于TCR研究的人組織抗原未降解可用于IHC的證據(jù)。常用的抗體包括血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1/CD31)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin Receptor, CD71) 及β2微球蛋白。如果某一套人組織與上述組織可接受性抗體IHC無(wú)染色，表明該套人組織不適用于TCR研究。
V.試驗(yàn)濃度的設(shè)計(jì)
在TCR試驗(yàn)中，首先需將標(biāo)記好的單抗藥物梯度稀釋后，分別對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組織進(jìn)行染色，建立免疫組化方法學(xué)參數(shù)[12]。
- 最佳濃度：應(yīng)選擇與陽(yáng)性組織出現(xiàn)明顯結(jié)合的最低濃度；需注意最佳濃度的設(shè)置不可過(guò)低，否則會(huì)影響試驗(yàn)敏感性。
- 最高濃度：應(yīng)選擇與陽(yáng)性組織出現(xiàn)明顯結(jié)合，但未在陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組織產(chǎn)生非特異性著色的最高濃度，這樣才能保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性。
VI.結(jié)果判定
在TCR研究中，合理利用和分析陽(yáng)性及陰性對(duì)照組的結(jié)果可以在一定程度上解決試驗(yàn)中的“假陽(yáng)性”和“假陰性”[13]，在排除以上干擾因素后，再?gòu)娜旧珡?qiáng)度、分布范圍、分布定位、非標(biāo)記物特異性著色四方面進(jìn)行結(jié)果分析。對(duì)于抗體藥物與非靶器官存在的交叉反應(yīng)，在最終的評(píng)估中必須經(jīng)過(guò)多方面考慮，從而為預(yù)測(cè)藥物可能發(fā)生的毒性反應(yīng)提供客觀的依據(jù)。
VII.其他
針對(duì)雙特異性抗體是否進(jìn)行單獨(dú)親本檢測(cè)，不同指導(dǎo)原則做出了不同的要求（表2）。因此，針對(duì)雙特異抗體的TCR研究的設(shè)計(jì)，需要從多方面進(jìn)行綜合考量。
【表2】不同指導(dǎo)原則對(duì)于雙特異性抗體TCR研究的規(guī)定
單克隆抗體類藥物作為當(dāng)前生物藥研究的熱點(diǎn)，需要充分考慮其安全性，組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)在藥物臨床前的安全性評(píng)價(jià)中非常重要。目的是確認(rèn)受試抗體與藥效靶組織抗原表位的結(jié)合，檢測(cè)抗體是否與非靶部位組織抗原結(jié)合，幫助非臨床安全性試驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物種屬確定及毒性靶器官的預(yù)測(cè)。TCR研究要充分解讀國(guó)內(nèi)外指導(dǎo)原則，保證該研究過(guò)程的科學(xué)性、結(jié)果的可靠性，為將來(lái)臨床用藥提供參考。
有濟(jì)醫(yī)藥的組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)平臺(tái)配備科學(xué)、先進(jìn)的儀器設(shè)備，擁有多種屬、多個(gè)體、全套的冰凍組織，配有經(jīng)驗(yàn)豐富的專題負(fù)責(zé)人和病理技術(shù)人員，提供全面的組織交叉反應(yīng)研究設(shè)計(jì)及分析服務(wù)，支持確定非臨床安全性試驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物種屬及毒性靶器官的預(yù)測(cè)。
參考文獻(xiàn)：
[1] 呂建軍,張碩,林志,屈哲,霍桂桃,楊艷偉,張頔,汪巨峰,李波.單克隆抗體及基于抗體類藥物組織交叉反應(yīng)研究現(xiàn)狀及關(guān)注點(diǎn)[J].藥物分析雜志,2015,35(12):2061-2069.
[2] Leach MW, Halpern WG, Johnson CW, Rojko JL, MacLachlan TK, Chan CM, Galbreath EJ, Ndifor AM, Blanset DL, Polack E, Cavagnaro JA. Use of tissue cross-reactivity studies in the development of antibody-based biopharmaceuticals: history, experience, methodology, and future directions. Toxicol Pathol. 2010 Dec;38(7):1138-66.
[3] 牟大超,周軼,白秀峰.單克隆抗體技術(shù)進(jìn)展及上市藥物分析[J].藥物生物技術(shù),2022,29(01):87-94.
[4] 付志浩,徐剛領(lǐng),黃璟,于傳飛,王蘭,王軍志.單克隆抗體藥物研發(fā)進(jìn)展[J].中國(guó)藥事,2021,35(11):1253-1268.
[5] LiverTox: Clinical and Research Information on Drug-Induced Liver Injury [Internet]. Bethesda (MD): National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases; 2012-. Monoclonal Antibodies. [Updated 2023 Feb 28].
[6] 林志,屈哲,呂建軍等.單克隆抗體類藥物組織交叉反應(yīng)常見問(wèn)題的探討[J].中國(guó)新藥雜志,2012,21(14):1600-1602+1606.
[7]U.S.FOOD AND DＲUG ADMINISTＲATION ( FDA) ．Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use［EB /OL］.1997.
[8] ICH S6 (R1). Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals［EB /OL］．2011.
[9] EUROPEAN MEDICINES AGENCY (EMEA ) ．Guideline on Strategies to Identify and Mitigate Risks for First-In-Human Clinical Trials with Investigational Medicinal Products［EB/OL］．2007.
[10] CFDA (國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局) CDE(藥品審評(píng)中心) ．Guideline on Quality Control Technique of Monoclonal Antibodies for Human Use (人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則)［EB/OL］. 2008.
[11] CFDA (國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局). Guideline on Research ＆ Development and Evaluation Technique of Biosimilar (on trial) (生物類似藥研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行) )［EB /OL］.2016.
[12] 祁德波,王新國(guó),富欣等.組織交叉試驗(yàn)中多路徑體系技術(shù)難點(diǎn)的探索和研究[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2017,40(10):1372-1377.
[13] 余珊珊,王海學(xué),胡曉敏等.組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)在非臨床安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用及案例分析[J].中國(guó)新藥雜志,2016,25(06):634-638.
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