組織交叉反應(yīng)（Tissue Cross-Reactivity, TCR）研究是針對含有互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）的抗體和抗體樣分子推薦的篩選試驗(yàn)，目的是確認(rèn)受試抗體與藥效靶組織抗原表位的結(jié)合，檢測抗體是否與非靶部位組織抗原結(jié)合，確定非臨床安全性試驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物種屬及為毒性靶器官的預(yù)測提供參考[1，2]。
二、抗體類藥物發(fā)展與TCR研究的應(yīng)用
單克隆抗體(Monoclonal antibody, mAb) 類藥物是當(dāng)今生物制藥研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011～2023年，有80多種單克隆抗體藥物在美國FDA獲批上市。其中人源化單克隆抗體33種，占40.24%；全人源單克隆抗體32種，占39.02%；人鼠嵌合抗體5種，占6.09%；此外還有10種抗體藥物偶聯(lián)物( Antibody-drug conjugate, ADC) ，占12.19%和2種雙特異性抗體( Bispecific antibody, BsAb) ，占2.44%[3，4]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的深入研究，抗體藥物的應(yīng)用已涵蓋腫瘤、免疫性疾病、病原體感染性疾病、代謝性疾病、遺傳性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等領(lǐng)域[3](圖1)。
【圖1】A. 抗體結(jié)構(gòu)為輕鏈(L)和重鏈(H)，具有可變區(qū)(VL, VH)和恒定區(qū)(CL, CH)，由鏈間二硫鍵連接。綠色符號為抗原結(jié)合位點(diǎn)。B. 2011-2023年獲批上市的單克隆抗體藥物。
而抗體類藥物作為一種新型的生物技術(shù)藥物具有特定的免疫性。除了與適應(yīng)癥相關(guān)本身特定的靶器官外，如果人體正常組織細(xì)胞中存在相同或相似的抗原決定簇，藥物則可能會(huì)與非靶器官外的其他組織或細(xì)胞結(jié)合，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此抗體類藥物的組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)在藥物臨床前的安全性評價(jià)中非常重要[5，6]，需要研究者合理設(shè)計(jì)TCR研究及保證試驗(yàn)操作的規(guī)范性，有效控制試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而正確判定此類藥物是否存在組織交叉反應(yīng)，幫助非臨床安全性試驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物種屬確定及預(yù)測毒性靶器官，為臨床用藥提供參考。
三、組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)原則
截至目前，關(guān)于TCR研究國內(nèi)外發(fā)布了多個(gè)指導(dǎo)原則[7-11]（表1），對TCR試驗(yàn)的科學(xué)性和技術(shù)性進(jìn)行了全面闡述。
【表1】國內(nèi)外發(fā)布的TCR研究相關(guān)指導(dǎo)原則
四、組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)解析
FDA及NMPA均要求在I期臨床試驗(yàn)開展前，應(yīng)完成供試品與組織或細(xì)胞的交叉反應(yīng)研究或與非靶組織的結(jié)合研究。免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunocytochemistry, IHC）是TCR研究的主要方法（圖2），F(xiàn)DA及NMPA還支持使用除IHC外的其他方法，例如微量細(xì)胞毒性、流式細(xì)胞術(shù)和/或放射自顯影技術(shù)等。
【圖2】IHC操作圖
對于TCR研究組織材料的規(guī)定上，國內(nèi)外指導(dǎo)原則存在一些異同之處。
FDA：PTC指南
- 應(yīng)使用快速冰凍的成人（如果有）和（或）胎兒組織來進(jìn)行人重要器官、血液成分及預(yù)期靶細(xì)胞或組織的免疫組化研究；
- 至少3個(gè)無關(guān)聯(lián)的捐獻(xiàn)者來源的人體組織；關(guān)于死者的一般信息必須收集，包括年齡、性別、民族、病史以及死亡原因。所取組織最好是年齡＞18歲的成年人；
- 首選手術(shù)組織，也可使用尚未自溶的尸檢組織；
- 特殊情況下，可使用代表性的培養(yǎng)細(xì)胞系、干細(xì)胞及胚胎/胎兒組織；
【圖3】FDA規(guī)定的TCR研究人體組織清單
NMPA：《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》
- 來源于腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體應(yīng)進(jìn)行與各種腫瘤組織的交叉反應(yīng)試驗(yàn)。
I.組織材料：
TCR研究的組織材料選取需根據(jù)申報(bào)要求進(jìn)行個(gè)體化設(shè)計(jì)。依據(jù)美國FDA的PTC指南中的表述，組織材料應(yīng)為手術(shù)或者活檢的新鮮組織，用恰當(dāng)?shù)娜〔摹⒐潭氨４娣椒ㄖ苽涑杀鶅銮衅?。正常人體冰凍組織至少要選擇3套來自不同個(gè)體的捐獻(xiàn)者，而非人靈長類動(dòng)物及嚙齒類動(dòng)物冰凍組織則至少選擇2套來自不同的動(dòng)物個(gè)體。NMPA也允許選用石蠟組織樣本。
II.染色方法選擇：
免疫組織化學(xué)染色可分為直接法和間接法。最終采用何種方法取決于最佳的染色和最低的背景染色或非特異性染色，須考慮以下幾點(diǎn)∶①供試品的類型。②供試品的親和力。③臨床試驗(yàn)中的血漿濃度。④抗原決定簇的穩(wěn)定性。⑤能夠提高染色技術(shù)而使得大部分組織著色。
III.對照組設(shè)定：
對照組設(shè)定需考慮陽性對照、陰性對照及分析對照三部分。
陽性對照：
陽性一抗對照：與靶抗原特異結(jié)合的一抗，如果是抗體類生物類似藥TCR研究，目的包括與參照藥（原研產(chǎn)品）比對，建議包括陽性一抗對照參照藥；
- 陽性組織對照：靶抗原表達(dá)或過表達(dá)的組織切片，包括正常組織（自身對照）、腫瘤組織或炎癥組織；
- 陽性細(xì)胞系對照：表達(dá)靶抗原細(xì)胞系和/或轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；
- 陽性成瘤組織：表達(dá)靶抗原轉(zhuǎn)染細(xì)胞系裸鼠成瘤組織切片。
陰性對照：
- 陰性一抗對照：與一抗或供試品相同種屬、相同亞型正常IgG或同型IgG；
- 陰性細(xì)胞系對照：無靶抗原表達(dá)的細(xì)胞系和/或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；
分析對照：
- 分析對照常用磷酸鹽緩沖液代替一抗，可幫助分析背景性和/或非特異性染色是由于組織色素或染色方法引起。
IV.組織可接受性
組織可接受性對照是針對人組織普遍存在抗原的抗體，目的是提供用于TCR研究的人組織抗原未降解可用于IHC的證據(jù)。常用的抗體包括血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1/CD31)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin Receptor, CD71) 及β2微球蛋白。如果某一套人組織與上述組織可接受性抗體IHC無染色，表明該套人組織不適用于TCR研究。
V.試驗(yàn)濃度的設(shè)計(jì)
在TCR試驗(yàn)中，首先需將標(biāo)記好的單抗藥物梯度稀釋后，分別對陽性對照和陰性對照組織進(jìn)行染色，建立免疫組化方法學(xué)參數(shù)[12]。
- 最佳濃度：應(yīng)選擇與陽性組織出現(xiàn)明顯結(jié)合的最低濃度；需注意最佳濃度的設(shè)置不可過低，否則會(huì)影響試驗(yàn)敏感性。
- 最高濃度：應(yīng)選擇與陽性組織出現(xiàn)明顯結(jié)合，但未在陽性對照和陰性對照組織產(chǎn)生非特異性著色的最高濃度，這樣才能保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性。
VI.結(jié)果判定
在TCR研究中，合理利用和分析陽性及陰性對照組的結(jié)果可以在一定程度上解決試驗(yàn)中的“假陽性”和“假陰性”[13]，在排除以上干擾因素后，再從染色強(qiáng)度、分布范圍、分布定位、非標(biāo)記物特異性著色四方面進(jìn)行結(jié)果分析。對于抗體藥物與非靶器官存在的交叉反應(yīng)，在最終的評估中必須經(jīng)過多方面考慮，從而為預(yù)測藥物可能發(fā)生的毒性反應(yīng)提供客觀的依據(jù)。
VII.其他
針對雙特異性抗體是否進(jìn)行單獨(dú)親本檢測，不同指導(dǎo)原則做出了不同的要求（表2）。因此，針對雙特異抗體的TCR研究的設(shè)計(jì)，需要從多方面進(jìn)行綜合考量。
【表2】不同指導(dǎo)原則對于雙特異性抗體TCR研究的規(guī)定
單克隆抗體類藥物作為當(dāng)前生物藥研究的熱點(diǎn)，需要充分考慮其安全性，組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)在藥物臨床前的安全性評價(jià)中非常重要。目的是確認(rèn)受試抗體與藥效靶組織抗原表位的結(jié)合，檢測抗體是否與非靶部位組織抗原結(jié)合，幫助非臨床安全性試驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物種屬確定及毒性靶器官的預(yù)測。TCR研究要充分解讀國內(nèi)外指導(dǎo)原則，保證該研究過程的科學(xué)性、結(jié)果的可靠性，為將來臨床用藥提供參考。
有濟(jì)醫(yī)藥的組織交叉反應(yīng)試驗(yàn)平臺配備科學(xué)、先進(jìn)的儀器設(shè)備，擁有多種屬、多個(gè)體、全套的冰凍組織，配有經(jīng)驗(yàn)豐富的專題負(fù)責(zé)人和病理技術(shù)人員，提供全面的組織交叉反應(yīng)研究設(shè)計(jì)及分析服務(wù)，支持確定非臨床安全性試驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物種屬及毒性靶器官的預(yù)測。
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