免疫原性（Immunogenicity）是指藥物和/或其代謝物誘發(fā)對自身或相關(guān)蛋白的免疫應(yīng)答或免疫相關(guān)事件的能力。當(dāng)治療類蛋白產(chǎn)品作為藥物時，會被機體識別為外來物質(zhì)而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但對于治療性蛋白的不必要或非預(yù)期的免疫應(yīng)答則會給藥物的安全和療效帶來風(fēng)險，甚至?xí)驗榭顾幙贵w和內(nèi)源蛋白交叉給病人帶來生命危險。

機體的免疫反應(yīng)通常包括兩種類型，一種是固有免疫，主要包括皮膚、粘膜及體液中的殺菌物質(zhì)所構(gòu)成的第一道和第二道防線。另一種為適應(yīng)性免疫，又稱特異性免疫，也是免疫原性研究主要討論和監(jiān)測的范疇。適應(yīng)性免疫主要包括體液免疫（通過B細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生特定ADA）和細(xì)胞免疫（通過T細(xì)胞介導(dǎo)釋放細(xì)胞因子）。對于大多數(shù)藥物，不良免疫反應(yīng)通常由體液免疫介導(dǎo)，但對于細(xì)胞基因治療類的產(chǎn)品，除體液免疫外，還需要更多的關(guān)注細(xì)胞免疫。

免疫原性研究中檢測的抗體通常包括:(1)抗藥抗體(Anti-Drug Antibody,ADA):通常特指抗藥結(jié)合抗體;(2)中和抗體(Neutralizing Antibody,NAb):是指能夠干擾藥物與其靶點相互作用的抗藥抗體。中和抗體往往能夠極大的降低或中和藥物的藥效作用，所以必要情況下還需要開展中和活性試驗評估抗藥抗體對藥物的中和能力/程度。當(dāng)然，除了疫苗類產(chǎn)品以外，中和抗體通常都是非預(yù)期產(chǎn)生的抗體。

1.1內(nèi)源性因素

• 藥物的氨基酸序列：相比于人源化氨基酸序列，非人源氨基酸序列的藥物更易產(chǎn)生ADA。
• 結(jié)構(gòu)修飾：為了增強療效或改變半衰期，人為對序列進行結(jié)構(gòu)修飾（包括唾液酸修飾、氨基酸位點突變、去海藻糖、融合蛋白、PEG化等）。這些結(jié)構(gòu)變化均是引起免疫原性發(fā)生的風(fēng)險因素。
  
  
  1.2外源性因素
  
  
• 產(chǎn)品工藝：多聚體、雜質(zhì)、去末端氨基酸和降解。如藥物產(chǎn)品在制備過程中引入了較高水平的雜質(zhì)，包括多聚體、降解產(chǎn)物、變性蛋白等，則ADA的發(fā)生率會相對高一些。
• 制劑：輔料、包裝材料等。
• 治療相關(guān)因素：如給藥途徑、頻率等。相比于靜脈、口服給藥，通常采用皮內(nèi)、吸入給藥的途徑更易產(chǎn)生ADA；連續(xù)多次給藥相比于單次給藥ADA的發(fā)生率通常更高些。
• 患者相關(guān)因素：自身免疫性疾病患者的免疫系統(tǒng)通常處于激活狀態(tài)，一般更易產(chǎn)生ADA，相反如患者的免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，則不易產(chǎn)生ADA。

免疫原性的產(chǎn)生影響廣泛，從無臨床意義抗藥抗體的暫時出現(xiàn)，到能夠改變藥物藥效或產(chǎn)生副作用，甚至嚴(yán)重到危及生命。主要影響以下幾方面：

• 安全性：ADA的產(chǎn)生會導(dǎo)致機體發(fā)生藥物過敏反應(yīng)；對于免疫調(diào)節(jié)類藥物，可能會導(dǎo)致免疫細(xì)胞過度活化，促炎性因子快速釋放而引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴；抗原抗體復(fù)合物的形成也會帶來安全風(fēng)險。
• 藥效學(xué)：中和抗體的產(chǎn)生可能降低或中和藥物療效，改變藥物生物分布。
• 藥動學(xué)：改變組織分布，改變清除率及體內(nèi)暴露量，干擾血藥濃度測定。

免疫原性研究貫穿藥物研發(fā)、非臨床研究、臨床研究、上市后藥物監(jiān)測的整個生命周期，是藥物研發(fā)的重要組成部分。在免疫原性全程式研究中，應(yīng)始終關(guān)注抗藥抗體生成與藥代/藥效動力學(xué)、療效以及安全性之間的相關(guān)性。

治療性蛋白藥物通常具有種屬差異，基于動物免疫原性研究結(jié)果預(yù)測人體免疫原性具有局限性。但是，在非臨床研究中進行免疫原性評價仍然具有一定意義。免疫原性相關(guān)反應(yīng)可導(dǎo)致非臨床研究結(jié)果復(fù)雜化并難以解釋，免疫原性數(shù)據(jù)有助于安全性數(shù)據(jù)的整體解讀和分析。而臨床試驗中對于抗藥抗體的檢測更是成為了藥監(jiān)局的監(jiān)管要求。

• 評價藥物通常包括治療性蛋白、多肽及其衍生物、ADC、細(xì)胞產(chǎn)品、基因治療藥物、病毒載體類藥物等。
  
• 免疫原性為定性研究，主要聚焦在抗藥抗體的檢測和表征。通常應(yīng)獲得ADA的發(fā)生率、滴度、存續(xù)時間和中和能力等數(shù)據(jù)；必要時可對抗體同種型、亞型、結(jié)合表位或與內(nèi)源性蛋白的交叉反應(yīng)性進行確認(rèn)。
  
• 免疫調(diào)節(jié)類藥物需對動物體內(nèi)毒性試驗中的相關(guān)細(xì)胞因子變化水平進行監(jiān)測，并開展體外細(xì)胞因子釋放試驗。

ADA產(chǎn)生的機制主要包括兩種：T細(xì)胞依賴途徑和T細(xì)胞非依賴途徑。

• T細(xì)胞依賴途徑：藥物作為抗原被抗原提呈細(xì)胞（APC）攝取內(nèi)化，加工為抗原多肽片段；多肽-MHC II類分子與T細(xì)胞表面受體（TCR）識別并結(jié)合，激活T細(xì)胞；T細(xì)胞活化誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和分化為漿細(xì)胞，合成并分泌特定ADA（IgG）。此類型ADA免疫應(yīng)答作用強，持續(xù)時間長。
  
  
• T細(xì)胞非依賴途徑：藥物可直接作用B細(xì)胞表面受體（BCR），誘導(dǎo)B細(xì)胞分化漿細(xì)胞；同時樹突細(xì)胞也可將藥物提呈至B細(xì)胞，誘導(dǎo)B細(xì)胞分化漿細(xì)胞，合成并分泌特定ADA（IgM為主）。因為該途徑?jīng)]有T細(xì)胞輔助，產(chǎn)生的ADA主要為IgM型，親和力低、持續(xù)時間短、特異性差，且比T細(xì)胞依賴途徑的免疫應(yīng)答作用弱。

圖1. ADA的產(chǎn)生機制^[1]

ADA即為抗體，抗體是機體免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖、分化成的漿細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)免疫分子?？贵w介導(dǎo)體液免疫，主要分布在血清中，是可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。

根據(jù)產(chǎn)生的抗體重鏈的不同，ADA通常分為以下五種類型：IgG、IgE、IgM、IgA、IgD。各個抗體類型的特點如下表所示。

在ADA分析方法開發(fā)之前，應(yīng)充分了解目標(biāo)待測物，根據(jù)受試藥物性質(zhì)及特點選擇合適的分析方法，通常包括酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）、放射免疫分析法（RIA）、表面等離子體共振檢測法（SPR）、全自動納升級免疫分析工作站Gyrolab等。其中，應(yīng)用最為廣泛的方法主要包括ELISA法和ECL法。

• 直接ELISA：此法的優(yōu)勢在于能夠增加低親和力抗體的檢測，但缺點是僅能檢測單一亞型，且具有種屬特異性。
  
  
• Bridging-ELISA：此法的優(yōu)勢在于能檢測各類抗體亞型，無種屬特異性，可高通量檢測，缺點是不易檢測到低親和力的抗體。目前，該法也是業(yè)內(nèi)ADA檢測應(yīng)用較為廣泛的方法。

  
  

• ECL法：該法基于MSD平臺，優(yōu)勢在于可以檢測所有亞型，無種屬特異性，同時可以檢測低親和力抗體，靈敏度和耐受性高。所以，這種方法在臨床檢測中的應(yīng)用也比較廣泛。

圖2. ELISA和ECL法檢測ADA的原理示意圖

NAb的檢測方法通常包括兩種，一種是基于細(xì)胞的生物學(xué)試驗(cell based Assay，CBA)，一種是非細(xì)胞的配體競爭性試驗(non-cell competitive ligand-binding assay，CLBA)。這兩種方法的選擇通?；谝韵聨讉€因素：①由藥物類型和藥物作用機理（MOA）決定；②方法性能（如數(shù)據(jù)的可靠性）；③藥物免疫原性的風(fēng)險。目前，CBA法是被監(jiān)管部門認(rèn)為是衡量藥物產(chǎn)生中和抗體傾向的金標(biāo)準(zhǔn)。但對于拮抗型單克隆抗體通常首選CLBA（通過結(jié)合發(fā)揮作用的），受體激動劑的藥物或者ADC藥物推薦首選CBA。以下為兩種方法優(yōu)劣勢的比較。

歐洲藥品監(jiān)管機構(gòu)（EMA）于2007年發(fā)布首版免疫原性評價的指導(dǎo)原則，并于2017年發(fā)布最終版本，適用的范圍包括蛋白質(zhì)、多肽及衍生物等。該版本對于免疫原性分析的技術(shù)細(xì)節(jié)并未作過多規(guī)定，申辦方可根據(jù)適用目的原則選擇最優(yōu)的方法來滿足監(jiān)管要求。

美國FDA于2014年首次發(fā)布了免疫原性評價指導(dǎo)原則。2016年，為適應(yīng)行業(yè)的發(fā)展及審評要求，又發(fā)布了針對ADA檢測方法開發(fā)和驗證的指導(dǎo)原則草案并于2019年正式生效。

國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）于2020年08月發(fā)布了《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》，并于2021年03月發(fā)布正式版本，填補了我國免疫原性研究相關(guān)技術(shù)規(guī)范的空白。該版指導(dǎo)原則中對于免疫原性的整體評估策略與EMA、FDA指導(dǎo)原則基本一致，不同之處在于NMPA正式版對非臨床和臨床免疫原性分析方法的差別作了較為詳細(xì)的區(qū)分。

此外，相關(guān)組織協(xié)會（如歐洲生物分析論壇）也會定期召開行業(yè)會議，發(fā)布免疫原性方面的白皮書，這些白皮書針對免疫原性的熱點問題也會給予諸多指導(dǎo)。

圖3.免疫原性多層級策略示意圖

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